În urma evenimentelor nefericite din prima parte a secolului al XIX-lea, mănăstirea Sfântul Spiridon-Nou se afla în ruină, fapt care a făcut ca în anul 1852 marea epitropie, cu acordul domnitorului Barbu Știrbei și binecuvântarea Mitropolitului Nifon Rusăilă (1789-1875), să decidă rezidirea din temelie a unei frumoase biserici. Noua biserica a fost construită între anii 1852-1858 după planurile renumitului catalan Xavier Villacrosse (1790-1855), fost arhitect șef al Bucureștiului cu o vastă experiență în domeniul proiectării. Piatra de temelie a noii biserici s-a pus la 20 septembrie 1852 în cadrul unei slujbe săvârșite de mitropolitul Nifon (1850-1875), în prezența domnitorului Barbu Dimitrie Știrbei (1849-1853 și 1854-1856) și a boierilor din Divanul țării.
Astfel, beneficiind de veniturile aduse de daniile predecesorilor, dar și de alte importante contribuții, epitropia bisericii a dorit să construiască un lăcaș de cult cu dimensiunile 41 de metri în lungime, între 14 – 20 de metri în lățime și 38 de metri în înălțime, ziduri groase din cărămidă, așezate pe o fundație de piloni din stejar. S-a propus, astfel, ca biserica să exprime tradiția românească, în contextul modernizării și europenizării atât de dorite de clasa politică din acea vreme. Ridicarea noii biserici a fost finalizată în octombrie 1858, stilul construcției fiind o combinație de elemente neogotice, romanice, baroce, renascentiste, neobizantine și românești. Pictura murală și catapeteasma au fost realizate în stil renascentist între anii 1858-1860 de către pictorul Gheorghe Tattarescu (1820–1894), considerat la acea vreme cel mai mare pictor român de biserici. Catapeteasma a fost realizată din lemn de tei și brad cu garnituri sculptate, reprezentând motive geometrice, florale, vegetale și ornamentale. Încununarea acestor eforturi a fost împlinită prin târnosirea bisericii în data de 8 noiembrie 1860 de către mitropolitul Nifon.
În anul 1885, un vânt puternic a dărâmat foișoarele celor două turnuri de la fațada principală, precum și pe cel de la turla cea mare, care, fiind reparate, au fost micșorate. Nu s-a mai păstrat însă forma lor anterioară, realizată în stil gotic. Ceva mai multă atenție a necesitat turla cea mare, care a fost repictată de Gheorghe Ioachim Pompilian, păstrând linia stilului abordat de Gheorghe Tattarescu. Despre vitregirea bisericii de impunătoarele foișoarele de pe turle avea să consemneze George Ioan Lahovary spunând următoarele: „la anul 1858 s-a rezidit din temelie și era cea mai măreață și cea mai frumoasă biserică din capitală. În urma reparației din anii din urmă i s-au schimbat turlele din față, așa că și-a pierdut cu totul stilul vechi. În orice caz rămâne una din bisericile mari și demne de văzut ale capitalei. Biserica pare și mai mare și mai înaltă, prin faptul că se înalță între mulțimile de case mărunte ale mahalalelor dimprejur”.
Momentul căderii foișoarelor nu a fost ultimul moment neplăcut din viața bisericii. Cutremurele de peste 6,5 pe scara Richter din anii 1893, 1894, 1896, 1903, 1908 au dus la mari degradări. Astfel, începând cu anul 1912, la inițiativa preotului paroh Ioan Oprescu și cu sprijinul epitropului Scarlat I. Ghica s-au astupat crăpăturile zidurilor, stâlpii și coloanele au fost îmbrăcate în stucatură de marmură și s-au montat vitraliile comandate special la Viena. Din nefericire, nici Primul Război Mondial nu a ocolit biserica. După relatările lui Mircea Constantinescu, în aprilie 1917 soldații germani și bulgari, primind ordin de a topi clopotele bisericilor din București, au topit și clopotul de la biserica Sfântul Spiridon-Nou care fusese făurit în timpul Sfântului Constantin Brâncoveanu.
Biserica a fost puternic afectată de cutremurul de mare intensitate din noiembrie 1940 (7,4 grade pe scara Richter) și de bombardamentele din aprilie și august 1944. Patriarhul Justinian Marina, întronizat în această biserică la 6 iunie 1948, constatând nevoia unor lucrări de punere în valoare a acestui locaș de cult, a hotărât în 1954 repararea lui. Astfel, în interiorul bisericii au fost adăugate două balcoane laterale rezemate pe stâlpi și un al treilea balcon deasupra vestibulului de la intrare . Totodată au fost făcute reparații la instalațiile electrice, la instalația de încălzire, la acoperiș, fațade și a fost restaurată pictura. Lucrările au fost realizate după proiectul arhitecților Grigore Ionescu, Gheorghe Naumescu și al inginerului Luigi Cora. După finalizarea lucrărilor de înfrumusețare, în data de 24 octombrie 1954, a fost oficiată slujba de sfințire a bisericii de către Patriarhul Justinian Marina și Patriarhul Chiril al Bulgariei, biserica primind titulatura, începând cu această perioadă, de Paraclis Patriarhal, ca loc principal unde să aibă loc hirotoniile episcopilor vicari, întronizările și vizitele la nivel înalt bisericesc.
Dacă până în anul 1948 veniturile rămase de la fondatori au fost sursa principală pentru întreținerea și consolidarea bisericii prin lucrări realizate sub directa supraveghere și coordonare a urmașilor ctitorilor, după instalarea regimului comunist și preluarea a ceea ce a mai rămas din moșiile bisericii (în mare parte expropriate, în urma reformei agrare din 1921), Patriarhii României au fost salvatorii acestui monument unic, sprijinind financiar lucrările de conservare a bisericii din fondurile Arhiepiscopiei Bucureștilor. Astfel, tot cu purtarea de grijă și binecuvântarea Patriarhului Justinian Marina, între anii 1966-1970 au fost efectuate lucrări de sub- zidire , înlocuindu-se fundațiile inițiale așezate pe grătare și piloni de stejar (bătuți în terenul în care nivelul apelor subterane este foarte ridicat, fiind în apropierea Dâmboviței) cu un radier general din beton armat. De asemenea au fost consolidate turlele și bolțile, a fost înlocuită pardoseala din interiorul bisericii cu marmură și au fost închise crăpăturile în ziduri, după un proiect întocmit de acad. prof. ing. Aurel Beleș, ing. Luigi Cora și ing. Dumitru Gheorghe Popescu. Aceștia au constatat că, din punct de vedere structural, intervenția din 1954 nu a fost o intervenție fericită deoarece au fost slăbite cele patru structuri majore de susținere a construcției, prin realizarea în grosimea acestora a unor galerii de circulație și astfel, biserica era în pericol să se dărâme sub propria greutate.
În timpul Patriarhului Justinian Marina, biserica a servit ca locație pentru cele mai importante evenimente bisericești, dintre care amintim: vizita Patriarhului Alexei I al Rusiei (3 iunie 1962), vizita Patriarhului Gherman al Serbiei și Macedoniei (28 octombrie 1962), vizita arhiepiscopului de Canterbury, Arthur Michael Ramsey (6 iunie 1965), vizita Patriarhilor Chiril al Bulgariei, Efrem al II-lea al Georgiei, arhiepiscopilor Ieronim I al Atenei și al întregii Elade, Paavali al Finlandei și a mitropolitului Filaret al Kievului cu ocazia aniversării la 20 de ani de la întronizarea Patriarhului Justinian Marina (6 iunie 1968), vizita Patriarhului Nicolae al VI-lea al Alexandriei și al întregii Africi (26 octombrie 1971), vizita Patriarhilor Maxim al Bulgariei și Șenuda al III-lea al Bisericii Copte din Egipt (15 octombrie 1972), vizita Patriarhului Pimen I al Moscovei (26 octombrie 1972), vizita Patriarhului Maxim al Bulgariei și a mitropolitul Vasile al Varșoviei și întregii Polonii (2 noiembrie 1975).
Un moment dificil prin care a trecut biserica a fost cutremurul din 4 martie 1977. În urma lui s-a prăbușit turla mică din colțul de sud-vest al bisericii, iar cea din nord-vest nu s-a prăbușit, dar s-a deplasat cca. 7-10 cm către exterior, amenințând cu prăbușirea. De asemenea bolțile și arcele, precum și zidul timpan din partea de vest a bisericii au fost fisurate, fapt ce a determinat stabilirea unei soluții de consolidare a acestora. Pentru evitarea căderii turnului de nord-vest și pentru a nu se mări fisurile produse s-a dispus interzicerea imediată a circulației pe Calea Șerban Vodă între intersecțiile cu străzile Cuza Vodă și Principatele Unite. În urma constatărilor făcute de arhitecții Gheorghe Sion, Tudor Oteteleșanu și de inginerul Ștefan Lazăr, dar și cu binecuvântarea Patriarhului Justinian primită în 10 martie 1977, s-a trecut imediat la consolidarea bisericii și la refacerea turlei de sud-vest.
Ulterior, în urma lucrărilor de construcție a metroului bucureștean din 1986, biserica a suferit din nou avarii importante, însă de această dată în zona altarului. În data de 4 mai 1986, chiar în ziua de Paște, imediat după terminarea Sfintei Liturghii, zidul de est al bisericii s-a desprins, formând o gaură de aproximativ 10-20 cm între el și restul bisericii. În dimineața aceleiași zile a sosit la fața locului Patriarhul Iustin, care a constatat stricăciunile și a dispus închiderea temporară a lăcașului de cult. Acesta este momentul în care regimul comunist a intenționat să demoleze biserica, însă Patriarhul Teoctist, proaspăt învestit ca întâistătător al Bisericii Ortodoxe Române și hirotonit aici ca arhiereu la 5 martie 1950, a reușit să o salveze de la demolare, și, cu cheltuiala Arhiepiscopiei Bucureștilor, a inițiat renovarea acesteia. Consolidarea și reparațiile la edificiu s-au efectuat de o echipă condusă de inginerii Constantin Pavelescu și Nicolae Stănculescu, prin foraje de injecție până la 20 metri adâncime, restabilind verticalitatea altarului și întărind rezistența terenului de fundare. Totodată, pentru a îndepărta definitiv biserica de pericolul demolării, Patriarhul Teoctist a numit-o paraclis universitar al Institutului Teologic de grad Universitar din București. Cum proiectul pentru restaurarea clădirii institutului trebuia în prealabil aprobat de Ministerul Cultelor, Patriarhul Teoctist a atașat acestuia actele de consolidare a bisericii, reușind astfel să o scape de la demolare. Lucrările de renovare a bisericii, precum și restaurarea picturii murale au fost finalizate în anul 1990, iar mai apoi, la 16 decembrie s-a oficiat slujba de resfințire a acesteia de către Patriarhul Teoctist.
Spațiul generos și realizarea sa artistică deosebită au făcut ca și în timpul Patriarhului Teoctist în biserica Sfântul Spiridon-Nou să fie oficiate multe slujbe arhierești, uneori participând la aceste evenimente toți membrii Sfântului Sinod al Bisericii Ortodoxe Române. Astfel, după anii ’90 a avut loc de trei ori sfințirea Sfântului și Marelui Mir (în 15 aprilie 1993, 11 aprilie 1996 și 5 aprilie 2007), proclamarea canonizării sfinților români (20 iunie 1992), precum și numeroase hirotonii de episcopi, printre care cea a ÎPS Teofan Savu (cu titulatura de „Sinaitul”, actualul mitropolit al Moldovei) la 15 septembrie 1991, a PS Vincențiu Grifoni (cu titulatura de „Ploieșteanul”, actualul episcop al Sloboziei și Călărașilor) la 2 februarie 1994, a ÎPS Teodosie Petrescu (cu titulatura de „Snagoveanul”, actualul Arhiepiscop al Tomisului) la 3 aprilie 1994, a PS Ambrozie Meleacă (cu titulatura de „Sinaitul”, actualul episcop al Giurgiului) la 15 octombrie 2000, a ÎPS Ciprian Spiridon (cu titulatura de „Câmpineanul”, actualul episcop al Buzăului și Vrancei) la 22 septembrie 2002. Tot cu binecuvântarea vrednicului de pomenire Patriarh Teoctist, constatându-se nevoia consolidării și reabilitării catapetesmei bisericii, s-au restaurat între anii 2003-2004, pictura ei, precum și elementele decorative de pe catapeteasmă.
După alegerea Preafericitului Părinte Daniel în calitatea de Patriarh al Bisericii Ortodoxe Române, Catedrala Patriarhală din București a fost închisă în anul 2008 pentru lucrări de consolidare, renovare și restaurare. Biserica Sfântul Spiridon-Nou, aflată în vecinătatea Catedralei Patriarhale, a fost lăcașul de cult care a preluat temporar funcțiile acesteia. În această perioadă, în biserică au avut loc importante evenimente bisericești, iar slujbele oficiate aici au fost transmise în direct prin intermediul Radio Trinitas și TV Trinitas. Totodată, în aceea vreme biserica a adăpostit pentru moaștele Sfinților Împărați Constantin și Elena și ale Cuviosului Dimitrie cel Nou din Basarabi, ocrotitorul Bucureștilor aduse de la Catedrala Patriarhală.
Începând cu anul 2009, la inițiativa și cu binecuvântarea Preafericitului Părinte Patriarh Daniel, s-au efectuat lucrări de restaurare și punere în valoare a bisericii Sfântului Spiridon-Nou. Astfel, după realizarea în anul 2009 a expertizei tehnice a edificiului de către profesorul ing. Mircea Crișan, în anul 2010 au început lucrările de reparații capitale la acoperișul bisericii. Structura din lemn a fost înlocuită în întregime, iar tabla zincată a fost înlocuită cu tablă de titan-zinc. În anul 2011 au fost finalizate lucrările la acoperiș și începute lucrările de înfrumusețare exterioară a bisericii, care au fost încheiate în anul 2012. Tot între anii 2011-2012 s-a refăcut instalația electrică și instalația de iluminare a picturii murale, precum și instalația de sonorizare interioară și exterioară. Între anii 2010-2014, după întocmirea documentației tehnice necesare restaurării, s-a realizat restaurarea vitraliilor istorice, confecționate la Viena la începutul secolului al XX-lea, de către domnul Ioan Cadar și doamna Amalia Verzea. În anul 2014 s-au realizat vitraliile de la ușa de la intrare. Între anii 2012-2015 s-a realizat restaurarea picturii de către pictorii restauratori Gabriela și Alexandru Ștefăniță. Lucrările au fost supravegheate de către arhim. Veniamin Goreanu, preot coordonator, și de pr. Ionuț-Gabriel Corduneanu, administrator bunuri. Slujba de resfințire a picturii a fost săvârșită de către Preafericitul Părinte Patriarh Daniel, în data de 12 decembrie 2015, împreună cu Preasfințitul Părinte Timotei Prahoveanul, episcop-vicar al Arhiepiscopiei Bucureștilor și un ales sobor de preoți și diaconi. Între anii 2016 și 2019 au avut loc lucrări de înlocuire a pardoselei și a mobilierului din Sfântul Altar, iar curtea bisericii a fost reamenajată, înlocuindu-se treptele bisericii, montându-se piatră cubică și un gazon nou. Concomitent cu lucrările de la biserica, au fost renovate și cele două clădiri, Casa Spiridonia și Casa Trimitunda, care întregesc complexul.
Încununarea eforturilor depuse la această biserică în perioada 2009-2018, de către arhimandritul Veniamin Goreanu și părintele Ionuț-Gabriel Corduneanu, a fost resfințirea locașului de cult de către Preafericitul Părinte Patriarh Daniel, în data de 17 iunie 2019, cu prilejul sărbătorii Sfintei Treimi. La slujbă au participat Preasfințitul Părinte Varlaam Ploieșteanul, episcop-vicar patriarhal, și Preasfințitul Părinte Veniamin Goreanu, ales în anul anterior episcop al Episcopiei Basarabiei de Sud. Cu această ocazie Preasfințitul Părinte Veniamin a primit din partea Preafericitului Părinte Patriarh ordinul Sfântul Ioan Gură de Aur pentru ierarhi, iar părintelui Ionuț-Gabriel Corduneanu i s-a acordat cea mai înaltă distincție pentru clerici, Crucea Patriarhală.
În anul 2008, mai multe biserici din București au fost declarate „Paraclise Patriarhale”, întrucât acestea susțin activitățile misionare ale Patriarhiei Române. Pentru ca biserica Sfântul Spiridon-Nou să-și păstreze nota distinctă față de celelalte biserici, începând cu data de 1 septembrie 2012, biserica Sfântul Spiridon-Nou a fost ridicată de către Preafericitul Părinte Patriarh Daniel la rangul de „Catedrală Mitropolitană”, având un regim special față de celelalte biserici de parohie. Acest rang este unul onorific și nu unul administrativ, ea având un scop misionar deosebit și anume, nu este nici parohie, nici mănăstire, ci o biserică mare al cărei spațiu servește pentru multiple activități liturgice din viața Bisericii. Catedrala este îndeosebi renumită pentru generozitatea spațiului și solemnitatea cu care sunt oficiate Sfintele Taine ale Cununiei și Botezului.